微生物的測(cè)定——顯微鏡法
2021-09-16 13:22:32
天緯化學(xué)小編
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如何測(cè)定微生物的數(shù)量對(duì)于微生物研究至關(guān)重要，目前最常用的方法包括顯微鏡法、平板計(jì)數(shù)法、分光光度法、流式細(xì)胞法等，各有優(yōu)缺點(diǎn)，本文首先介紹顯微鏡法。細(xì)胞數(shù)量可以通過(guò)簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。顯微鏡計(jì)數(shù)可以對(duì)玻片上干燥的樣品或液體樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。干燥的樣品可以染色，以增加細(xì)胞與其背景之間的對(duì)比。對(duì)于液體樣品，計(jì)數(shù)室由刻蝕在載玻片表面的已知面積的正方形網(wǎng)格組成。在顯微鏡下，單位面積網(wǎng)格上的細(xì)胞數(shù)量可以數(shù)出來(lái)，每毫升懸浮液的細(xì)胞數(shù)就能簡(jiǎn)單計(jì)算出來(lái)(如下圖所示)。顯微計(jì)數(shù)是一種快速簡(jiǎn)便的微生物細(xì)胞數(shù)量估算方法，但存在以下問(wèn)題：如果沒(méi)有特殊的染色技術(shù)，就無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性一般；小小的細(xì)胞往往很難看的清楚，這可能導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)；如果細(xì)胞懸浮液的密度低(少于106個(gè)細(xì)胞/毫升)，視野中將幾乎沒(méi)有細(xì)胞；對(duì)于運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞，觀察前需要將其殺死(通常用甲醛)或固定；樣品中的雜質(zhì)會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色是常見(jiàn)的研究手段。例如，DAPI(4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)能夠染色所有細(xì)胞，因?yàn)樗軌虼┩讣?xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生比自身強(qiáng)20多倍的熒光，DAPI染劑利用紫外光激發(fā)，與DNA結(jié)合時(shí)最大吸收波長(zhǎng)為358 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)461 nm；熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，但染料不能透過(guò)細(xì)胞膜，常用于死細(xì)胞的檢測(cè)。因此，DAPI/PI染色經(jīng)常組合使用，用于檢測(cè)細(xì)胞的生存狀態(tài)。通過(guò)將熒光染料附著在特定的核酸探針上，可以制備出對(duì)某些生物(群)具有高度特異性的熒光染色劑，這方面用的很多的是熒光原位雜交(FISH)。基于催化特定代謝過(guò)程的功能基因的熒光探針也已開(kāi)發(fā)出來(lái)，如果細(xì)胞被這些探針染色，就可以推斷它們具有行使該代謝的能力，對(duì)研究微生物生態(tài)很有幫助。
參考資料：
Brock Biology of Microorganisms, 15th Edition
5.6 Microscopic Counts of Microbial Cell numbers
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